退火温度(Annealing Temperature) 为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度·它是影响PCR特异性的较重要因素。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。在模板变性后温度快速冷却至40℃~60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。