双光子荧光显微成像（two-photon microscopic imaging），理学-心理学-生物学技术-〔行为药理与生化〕，结合了共聚焦激光扫描显微镜和双光子激发技术的一种新型非线性光学成像技术。双光子荧光显微成像是一种新型非线性光学成像方法，由于其优异的特性，已被广泛应用于生物细胞和组织的长时间动态三维成像。1990年，美国康奈尔大学的W.登克等人将双光子激发用于荧光激发系统，制造出第一台双光子荧光显微镜。双光子荧光显微成像的原理是两个光子几乎“同时”（0.5飞秒之内）到达一个携带有荧光基团的生物分子，生物分子吸收光子的能量后进入活跃态，进而被激发出荧光。实际上，生物分子可以吸收更多的光子以达到活跃状态，吸收光子的效率和生物分子的物理性质及光源的时空分布有关。双光子荧光显微成像的优点有：兼具近红外激发、暗场成像、可避免荧光漂白和光致毒、定向靶向激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等。该方法主要用于心理和行为细胞突触等亚细胞水平机制的研究。