核酸外切蛋白酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸(DNA为dNMP，RNA为NMP)。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切蛋白酶和双链的核酸外切蛋白酶。大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ(exo Ⅲ)具有多种催化功能，可以降解双链DNA分子中的许多类型的磷酸二酯键。其中主要的催化活性是催化双链DNA按3′→5′的方向从3′-OH末端释放5′-单核苷酸。大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ(exoⅢ)通过其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。